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食品微生物检验GB4789.3-2016大肠菌群计数及注意事项
发布时间：2020-08-28 浏览次数：25411 分享：
一、大肠菌群定义和卫生学意义
大肠菌群定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上分类命名，它不代表某一种或某一属的细菌，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、肠杆菌属（又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）和等。
卫生学意义：大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。表示了对人体健康是否具有潜在的危险性。直接反映了样品受粪便污染的的程度。
二、GB4789.3-2016大肠菌群MPN法
1. 什么是MPN法？
•MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
•MPN值并不能表示实际菌落数， 实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。
•灵敏度较高，适用于污染菌落较少的样品。
2. 大肠菌群MPN计数的检验操作
3. 培养基原理解析
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）
•月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌生长，胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂。
•36±1℃培养24h后若已产气，则可停止培养。如果没有观察到有产气的现象，则继续培养至48±2h。
•如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤。
- +
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
•胆盐与煌绿均能抑制革兰氏阳性菌生长。
•培养基配方当中含有胆盐，大肠菌群发酵乳糖所产的酸会与胆盐发生反应，形成胆酸沉淀。培养基可由原来的绿色变为黄色。
阴性 阳性
4. 大肠菌群最大可能数（MPN）报告
•确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表，报告每1g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
•当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度（可做4~5个稀释度），使样品最高稀释度能达到阴性终点(如果污染程度不能判定，则多加一稀释度），然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。
表:大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳 性 管 数 | MPN | 95%可 信 限 | 阳 性 管 数 | MPN | 95%可 信 限 | ||||||
0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | ||
0 | 0 | 0 | <3.0 | — | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
0 | 0 | 1 | 3.0 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 0 | 3.0 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1000 |
2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1000 |
2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2000 |
2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1100 | 180 | 4100 |
2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1100 | 420 | — |
注1:本 表 采 用3个 稀 释 度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每 个 稀 释 度 接 种3管 。 注2:表 内 所 列 检 样 量 如 改 用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表 内 数 字 应 相 应 降 低10倍;如 改 用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则 表 内 数 字 应 相 应 增 高10倍,其 余 类 推 。 | |||||||||||
三、GB4789.3-2016大肠菌群计数平板法
1. 大肠菌群平板计数法流程图
2. 培养基原理解析
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
•配方中胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，中性红作为指示剂，在酸性条件下为紫红色。
•大肠菌群分解乳糖所产的酸与胆盐结合，可形成粉红色菌落菌落周围有胆酸盐沉淀环。
•该培养基无需高温高压灭菌，现配现用。
大肠埃希氏菌ATCC25922在VRBA上的菌落形态
3. 计数典型和可疑菌落数
结果判读：选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。
证实试验：从各样品中接种同一样品浓度的VRBA平板上共挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
4. 大肠菌群平板计数的报告
•经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
•若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则小于1乘以最低稀释倍数计算。
四、质量控制
1. 实验室过程中，每批样品稀释液都要做空白对照。
2. 为了控制环境污染，每次检验过程中，于检验台上打开两块计数琼脂平板，并在检验环境中暴露不少于15分钟，将此平板与本批次样品同时进行培养，以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
3. 定期使用大肠埃希氏菌ATCC25922或相应定量活菌参考品，在P2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，并进行记录，次验证实验至少每2个月进行1次。
五、大肠菌群测试片法
1. 原理：大肠菌群检测片由轻便防水纸质材料做支撑，其上覆盖干燥培养基层（营养物质、凝固剂、选择抑制剂、显色剂）和透明隔水膜组成，经辐照灭菌。可用于食品、饮料等的大肠菌群计数。含有四氮唑指示剂菌落为红色，发酵乳糖产酸和产气。
2. 特点优势
•菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒分开，无菌落重叠现象；
•菌落分布特别均匀；
•避免了培养基对细菌热损伤有关；
•菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生
•经济环保 无粉尘，体积小，重量轻，易储运
•保质期长干制无水培养基，性质稳定，保质期更长
六、所需培养基试剂和质控菌株
用途 | 货号 | 名称 | 规格 |
样品稀释 | CP0630 | 生理盐水 | 盒（袋装）225 mL×10袋 |
CP0511A | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 盒（瓶装）225 mL×6瓶 | |
CP0640 | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 盒（袋装）225 mL×10袋 | |
022117 | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 瓶（干粉）250 g | |
CP0310 | 生理盐水 | 盒（管装）9 mL×20支 | |
MPN法计数初发酵试验 | 022210 | 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） | 瓶（干粉）250g |
022210P1 | 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST) | 瓶（颗粒）250 g | |
022210A | 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） | 盒（管装）10 mL×20支 | |
22210G1 | 双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 | 盒（管装）10 mL×20支 | |
平板计数 | 022221 | 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） | 瓶（干粉）250g |
022221P1 | 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） | 瓶（颗粒）250g | |
C22221B1 | 结晶紫中性红胆盐琼脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
MPN法复发酵和平板计数证实 | 022220 | 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） | 瓶（干粉）250g |
022220P1 | 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB) | 瓶（颗粒）250g | |
022220A | 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） | 盒（管装）10 mL×20支 | |
HANDYPLAT微生物测试片 | HP002 | 大肠菌群测试片 | 20片/包 |
Q-Strain定量质控菌株 | QS011A | 大肠埃希氏（ATCC25922） | 110-1100 CFU/瓶 |
QS011B | 大肠埃希氏菌（ATCC25922） | (0.6-2.0)×107CFU/瓶 |
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