更新 | GB4789.10-2016金黄色葡萄球菌检验及其注意事项
发布时间:2024-06-12 浏览次数:3986 分享:
金黄色葡萄球菌的生物学特性
生物学特性:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,直径0.4~1.2µm,呈葡萄串状排列;无鞭毛、无芽胞;在陈旧培养物中,衰老的菌体常转为革兰氏阴性。兼性厌氧菌,最适生长温度37°C,最适生长pH7.4;耐盐性强,可产黄色色素。
流行学特征:金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌,广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌在适当的条件下,能够产生肠毒素,引起食物中毒。近几年,金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的 25%左右,金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。
金黄色葡萄球菌的检验
第一法:定性检验
操作注意事项
1:使用均质袋进行前增菌时,应使用带有底托的均质袋架子,防止培养过程中前增菌袋子歪倒泄漏污染培养箱;
2:高压灭菌后,培养基中琼脂往往会分层在底部,应摇匀使用;
3:金黄色葡萄球菌在血平板上大部分为金黄色,但有时为白色色,形态鉴定时需注意;
4:如果BP平板在培养48小时后未见金黄色葡萄球菌可疑菌落,应挑取非典型菌落进行鉴定;
5:金黄色葡萄球菌在BP平板上有时可见到不分解脂肪的菌株,除每一偶不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。此外,从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,其外观可能较粗糙,质地较干燥。形态鉴定时需特别注意;
6:培养箱中叠放培养皿时,为防止中间平皿过热,高度不得超过6个平板;
第二法:平板计数法 | 第三法:MPN法 |
操作注意事项
1:在进行样本10倍稀释的过程中,吸管应插入检样稀释液液面2.5cm以下,取液应先高于1mL,而后将吸管尖端贴于试管内壁调整至1mL,这样操作不会有过多的液体粘附于试管外。而后将1mL液体加入另一9mL试管内时应沿管壁加入,不要触及管内稀释液晶,以防吸管外部粘附的液体混入其中影响实验结果。
培养基原理解析
▶ 蛋白胨和牛肉膏粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质;较高含量的氯化钠提供较高的渗透压,抑制大多数非葡萄球菌的微生物。
2、Baird-Parker琼脂
▶ 胰蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子;丙酮酸钠和甘氨酸刺激葡萄球菌的生长;氯化锂和亚碲酸钾抑制非葡萄球菌的微生物;含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黄使菌落产生透明圈,而脂酶作用则产生不透明的沉淀环;凝固酶阳性的葡萄球菌还能还原亚碲酸钾而产生黑色菌落。
▶ 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形, 表面光滑、 凸起、 湿润、 菌落直径为2 mm~3 mm,颜色呈灰黑色至黑色, 有光泽, 常有浅色(非白色) 的边缘, 周围绕以不透明圈( 沉淀) , 其外常有一清晰带。
金黄色葡萄球菌菌落黑色,周围具有不透明圈,其外有清晰带
3、金黄色葡萄球菌显色培养基
▶ 原理:显色剂与金黄色葡萄球菌具有的酶发生特异性反应,水解底物,释放出显色基团,在无色透明平板上,金黄色葡萄球菌产生粉红-紫红的边缘整齐菌落;抑菌剂可抑制杂菌的生长。
▶ 特点:使用方便,加热煮溶即可不需高压灭菌;结果颜色清楚,结果一目了然。
4、BHI肉汤
▶ 胰蛋白质胨和牛心浸出液提供氮源、维生素和生长因子;葡萄糖可为多种细菌提供能源;氯化钠维持均衡的渗透压;磷酸氢二钠为缓冲剂。
5、血平板
▶ 酪蛋白胰酶消化物、心胰酶消化物、肉胃酶消化物、酵母浸出粉、可溶性淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子;羊血是细菌生长繁殖的良好营养物质。在45~50℃的基础培养基中加入血液可以保存血液中某些不耐热的生长因子,同时血球不被破坏。
▶ 金黄色葡萄球菌菌落为金黄色,菌落周围可见完全透明溶血圈。
金黄色葡萄球菌黄色或白色菌落,有完全透明溶血圈
金黄色葡萄球菌测试片与3M方法拟合度良好 | 金黄色葡萄球菌测试片 金黄色葡萄球菌显品 - 紫红色菌落 |
测试片性能验证
生化鉴定原理解析
1、血浆凝固酶试验
▶ 致病性的金葡菌产生的血浆凝固酶,使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。
▶ 如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,判定为阳性结果。
▶ 必须注意,某些菌株在产生的葡激酶在延长孵育时间后可使凝块溶解使之产生假阴性。
金黄色葡萄球菌实时荧光PCR快检法
▶ 技术原理:基于实时荧光PCR技术,针对检测目标特异性基因片段设计引物和荧光探针并优化反应所需试剂组分,加入待检样品核酸即可进行扩增反应。在扩增过程中,荧光探针与目的基因片段结合,可被Taq酶分解并产生荧光信号,此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号,同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线,进而判定目标基因是否检出。
▶ 产品优势:快速提取,一步法核酸提取,快速高效,核酸提取效率高;操作简单,提供PCR反应体系预混液,直接加样检测,无需自行配制;特异性强,采用高特异性引物及探针,确保实验准确性;灵敏度高,采用高效的扩增酶,检测灵敏度可达10-100copies/test。
▶ 产品组成:
组分名称 | 规格×数量 |
预混液 | 1mL × 1管 |
阳性对照 | 200μL × 1管 |
阴性对照 | 200μL × 1管 |
裂解液 | 1mL × 2管 |
说明书 | 1份 |
质量控制及疑难解析
质量控制
1、实验室过程中,每批预增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
2、定期使用金黄色葡萄球菌ATCC6538或相应定量活菌参考品,在P2实验室或阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性实验验证,污染剂量应控制在10-100CFU/25g,并进行记录,验证实验至少每2个月进行1次。
3、每2个月将所使用的培养基和生化试剂用金黄色葡萄球菌的标准菌株或阴性菌株进行验证,并进行记录。
疑难解析
问:在增菌增菌结束后,肉汤未见微生物生长,是否可以终止实验?
答:不可以,因为肉汤可见的细菌浓度为107CFU/ml,在此浓度一下,肉眼不能发现微生物生长,但实际溶液中有微生物生长。
问:金黄色葡萄球菌溶血属于哪种类型?
答:细菌溶血的类型可分为三种,ɑ溶血,β溶血和γ溶血。γ溶血即为不溶血, ɑ溶血和β溶血都出现溶血现象,但区别在于ɑ溶血环中的红细胞未完全溶解,而β溶血环中的红细胞完全溶解,因此会出现透明的溶血环,金黄色葡萄球菌引起的溶血属于β溶血。
所需培养基试剂
用途 | 货号 | 名称 | 规格 |
稀释 | CP0310 | 生理盐水 | 9mL×20支 |
增 菌 | 024010 | 7.5%氯化钠肉汤 | 250g/瓶 |
024010P1 | 7.5%氯化钠肉汤 | 250g/瓶 | |
CP0700 | 7.5%氯化钠肉汤 | 225mL×10袋 | |
平 板 分 离 | 024040 | Baird-Parker琼脂基础 | 250g/瓶 |
029190 | 卵黄亚碲酸钾增菌液 Baird-Parker琼脂配套试剂 | 2.5mL×10支 | |
029192 | 卵黄亚碲酸钾增菌液 Baird-Parker琼脂配套试剂 | 25mL×6支 | |
024040A | Baird-Parker琼脂平板 | 90mm×20个 | |
024070 | 血平板 | 90mm×20个 | |
CRM012 | 金黄色葡萄球菌显色培养基 | 1000mL/瓶 | |
CRM012A | 金黄色葡萄球菌 显色培养基平板 | 90mm×20个 | |
纯 培 养 | 024053 | 脑心浸出液肉汤(BHI) | 250g/瓶 |
024053A | 脑心浸出液肉汤(BHI) | 10mL×20支 | |
022020 | 营养琼脂 | 250g/瓶 | |
022020P1 | 营养琼脂 | 250g/瓶 | |
CP0150 | 营养琼脂斜面 | 8.5mL×20支 | |
生化鉴定 | 029180 | 冻干血浆 | 10支/盒 |
KJD04L | 金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒(恒温荧光法) | 24test |
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