近20年人源诺如病毒体外培养的研究进展
发布时间：2024-12-06 浏览次数：102 分享：
人源诺如病毒（HuNoVs）是导致急性胃肠炎的主要病原体。由于缺乏合适的培养系统，HuNoVs的发病机制以及疫苗和药物的开发进展缓慢。虽然研究人员在上个世纪采用了多种方法在体外培养HuNoVs（图1），但病毒无法稳定增殖、病毒滴度低、重复试验不稳定等问题仍然不可忽视。
图1 诺如病毒体外培养方法[1]
背景介绍
诺如病毒可分为10个基因群（genogroups）和48个基因型（genotypes），而与人类感染相关的有五个基因群：GI、GII、GIV、GVIII和GIX。全球50%的诺如病毒疫情与GII.4基因型相关，自1990年代以来，该基因型的病毒株导致了六次大流行。在2014年冬季，GII.17在亚洲出现，逃逸了群体免疫，引发了中国和日本的广泛爆发，并在某些地区取代了GII.4。近年来，非GII.4病毒如GII.2和GII.3也在多个国家引发大规模疫情。
肠道上皮细胞系
肠道上皮细胞是HuNoVs从粘膜表面侵入内部时首先接触到的细胞类型。在阳性患者的近端小肠活检中观察到的病理特征包括绒毛缩短、黏膜炎症以及肠道上皮细胞出现空泡化现象，伴有微绒毛缩短。此外，对一名急性HuNoVGII.4悉尼毒株腹泻的儿科肠移植患者不同部位的肠道活检组织进行分析发现，人类诺如病毒靶向肠内分泌细胞（EECs），这是一种具有感觉和内分泌功能的特化上皮细胞。这些迹象表明肠道上皮细胞与HuNoV感染过程密切相关，因此研究人员最初试图在肠道上皮细胞中培养HuNoVs。
White等人特意将放射性标记的重组诺如病毒病毒样颗粒VLPs结合到13种不同的细胞系上，发现分化的人结肠癌细胞（Caco-2）与 VLPs的结合最多，显著高于未分化的Caco-2细胞和其他细胞。与此同时，当Duizer等人尝试将HuNoVs接种到包括Caco-2在内的八种人肠道上皮细胞系时，发现没有一种细胞系能够实现显著的基因拷贝数增加或新感染病毒的产生。
抗原呈递细胞
抗原呈递细胞（APCs）是一类能够摄取和处理抗原并将其呈递给T细胞的免疫细胞，包括巨噬细胞（MΦ）、树突细胞（DCs）和B细胞。Wobus等人于2003年发现了第一株小鼠诺如病毒（MNV），并随后发现MNV能够在DCs和MΦ中有效复制，因此建立了诺如病毒的首个细胞培养系统。尽管小鼠无法感染HuNoVs，但通过低剂量注射HuNoV VLPs可以在体内刺激IgG和IgA介导的适应性反应，因此推测HuNoVs在感染宿主后也会产生细胞适应性免疫反应。Ponterio等VLPs能够诱导APCs的激活和成熟。然而，当HuNoVs与来自易感个体的单核细胞亚群衍生的DCs和MΦ在体外培养时，发现部分外周血单核细胞衍生的DCs能够表达病毒VP1和VPg蛋白，但所有细胞中的病毒RNA拷贝数并未增加；2014年，Jones等人成功将HuNoVs GII.4毒株、MNV-1和MNV-3接种到B细胞系（BJAB细胞系）中，增加了病毒拷贝数并产生了结构/非结构蛋白，进一步证明了通过传代实验产生新感染病毒颗粒的可能性。然而该团队强调了实验成功需要考虑的多种因素；接种液必须是未经过滤的病毒阳性粪便上清液，因为肠道微生物的存在是HuNoV感染的重要共同因子。此外，参与的B细胞类型（可以在BJAB和Raji细胞中复制，但不能在Namalwa和HuNS1细胞系中复制）、它们的状态和密度也会影响感染的效率，此外还有培养基中胎牛血清的来源。尽管这个体外培养系统最初取得了一定成功，但仍然存在一些问题。这个培养系统只能适度增加HuNoV基因组拷贝数，不能产生体内观察到的病毒复制水平。
3D细胞聚集体
几十年来，HuNoVs的二维单层细胞培养系统一直以失败或低效率告终。在感染病毒的活体动物中，细胞在三维环境中协同工作，这种空间环境可能对病毒或其他传染病原体的感染至关重要。
1998年，美国国家航空航天局（NASA）报告了使用旋转壁反应器（RWV），该反应器模拟微重力和低流体剪切环境，使得其中培养的细胞能够形成极性和三维聚集体；这使得能够有效重建原生组织的结构，并模拟人类微环境。自引入以来，研究人员使用该反应器培养来自多个器官（淋巴、肺、肾、胃、肠、阴道等）的细胞聚集体，并深入探讨所涉及病毒的发病机制。Straub等人应用RWV技术，成功地在3D人胚小肠上皮（INT 407）聚集体中培养了两种HuNoV毒株（GI.1和GII.4），并进行了多次传代。感染HuNoVs一天后，细胞聚集体表现出空泡化和微绒毛缩短，从细胞载体上脱落；它们还呈现出细胞病理效应（CPE），细胞形态变得延长或扭曲。随后，研究团队在Caco-2的3D聚集体中培养了两种HuNoV毒株GI.1和GII.4；在感染的聚集体中显示出2–3 Log10的病毒RNA拷贝数。然而，其他实验室在使用相同方法培养3D聚集体的INT 407或Caco-2细胞后，没有病毒复制的迹象；不过观察到了细胞分化和顶端绒毛的形成。
人类肠道类器官（HIE）
2009年Hans Clevers团队成功地在体外培养了小鼠肠道干细胞，使其在非上皮生态位中形成具有多种分化细胞类型（包括干细胞、肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞）的绒毛肠上皮结构域，这些细胞具有长时间生长的能力。自那时以来，这项技术迅速发展，创造了肠道、脑、胃、肺、卵巢等多种类型的类器官。类器官能够模拟和反映人类器官在不同环境中的状态，因此被广泛应用于病原微生物感染、药物开发和筛选、再生医学和精准医学等多个领域。
人类肠道类器官（HIE）包含具有隐窝样增殖区的肠上皮的主要细胞类型。结合上皮单层细胞系的高通量与实验动物肠道的复杂性，HIE在研究人类肠道相关疾病方面得到了广泛应用，并为各种病毒的体外培养提供了新的方向
2016年，Mary K. Estes团队培养了来源于空肠的单层HIE，系统有效表征了不同亚型HuNoVs的复制（在96小时后，HuNoV基因组RNA增加了1.5–2.5 log10，感染细胞占35–45%，透射电子显微镜下可观察到典型的病毒颗粒结构）和传代（四次连续传代存在病毒的感染性后代的产生）。研究人员发现，胆酸等添加剂能够促进GII.3和GII.17两个亚型的复制，并促进GII.4亚型的复制；这项研究代表了HuNoVs体外培养的重大突破，极大推动了对HuNoVs的基础研究。实验结果被多个国家的实验室成功验证，多种HuNoVs基因型（GI.1、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.12、GII.14和GII.17）实现复制。
斑马鱼模型
斑马鱼因其发育透明、易于遗传操作以及具有与人类相似的免疫系统，成为了研究病毒与宿主相互作用的重要模型。在诺如病毒的研究中，科学家们利用斑马鱼的胚胎和幼鱼模型发现，诺如病毒能够感染斑马鱼的肠道上皮细胞，通过模仿人类的感染途径，斑马鱼模型帮助科学家解析诺如病毒如何与宿主细胞结合、进入细胞以及复制的详细过程。
在斑马鱼幼虫中复制在感染后第天达到峰值，至少可在6天内检测到。HuNoV GII.4 可以在幼虫之间连续传代2次。抗病毒治疗可检测到HuNoV复制减少了>2 log10，表明该模型适用于抗病毒研究。斑马鱼模型为筛选抗诺如病毒药物提供了一个有效的平台。通过在感染斑马鱼中测试不同的化合物，研究人员可以快速评估这些药物的活性，进而为疾病的治疗提供新的思路。
参考文献：[1] Cheng C, Cai X, Li J, Zhang X, Xie Y, Zhang J. In Vitro Culture of Human Norovirus in the Last 20 Years. Biomedicines. 2024, 24;12(11):2442.
来源：微生物安全与健康网，作者~薛亮。
