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更新 | GB4789.8-2016 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验及其注意事项
发布时间：2024-05-21 浏览次数：1160 分享：
小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物学特性
生物学特性：小肠结肠炎耶尔森菌革兰氏染色阴性，菌体呈球杆状，不形成芽孢，22℃~30℃培养时周身可形成丰富鞭毛，需氧厌氧条件均可生长，生长范围温度0℃~45℃，最佳生长温度为26℃。
流行学特征：是一种人兽共患病原菌，广泛分布于自然界中，在海产品、蛋类、鲜奶、饮料、速冻食品中可分离到该菌，是冰箱中存放食物的重要污染菌，被称为“冰箱菌”；主要通过人畜接触和粪口途径传播，感染后主要症状为腹泻、肠炎等，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼、结缔组织和其他一些全身性疾病症状。
小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验
增菌
▶ 以无菌操作取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内，以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。
▶ 液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。均质后于26℃1℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。
碱处理
▶ 除乳与乳制品外，其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。
分离培养
▶ 将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板，26℃±1℃培养48h±2h 。
▶ 注意事项：在CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板上划线分离时，应三区划线，且线条稀疏不宜过密，以免杂菌生长过大，掩盖可疑小肠结肠炎耶尔森菌的检出；
培养基原理解析
1、改良磷酸盐缓冲液
▶ 山梨醇提供碳氮源，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为缓冲液，胆盐抑制革兰氏阳性菌，氯化钠提供细胞所需要的渗透压。
2、CIN-1琼脂
▶ 胰胨和酵母浸膏提供氮源和微量元素；甘露醇为可发酵糖；去氧胆酸钠和结晶紫抑制革兰氏阳性菌；中性红是pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。。
▶ 小肠结肠炎耶尔森菌菌落为深红色中心，周围具有无色透明圈（红色牛眼状菌落），菌落大小为1-2mm。
小肠结肠炎耶尔森菌菌落深红色，周围具有无色透明圈（红色牛眼状菌落）
3、改良Y琼脂
▶ 蛋白胨和水解酪蛋白提供氮源和微量元素；乳糖用于糖发酵试验；氯化钠维持正常的渗透压，去氧胆酸钠和三号胆盐抑制革兰氏阳性菌；丙酮酸钠刺激目标菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。
▶ 小肠结肠炎耶尔森菌菌落为无色透明、不黏稠菌落。
小肠结肠炎耶尔森菌无色透明，不粘稠。
| CRM017 小肠结肠炎耶尔森氏菌在显色培养基上菌落特征 | |
|---|---|
 |  |
| 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌→淡紫色 | 非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和（枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、气单胞菌属等菌）→金属蓝色，在金属蓝色菌中生长被抑制或限制 |
小肠结肠炎耶尔森氏菌生化鉴定原理解析
1、改良克氏双糖试验
▶ 操作方法：分别挑取可疑菌落3个~5个，分别接种于改良克氏双糖琼脂，接种时先在斜面划线，再于底层穿刺，26℃±1℃培养24h 。
▶ 改良克氏双糖琼脂：蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏提供氮源、维生素、矿物质；山梨醇、葡萄糖提供可发酵糖类；硫代硫酸钠可被某些细菌还原成H2S，与铁离子生成黑色硫化铁；酚红是pH指示剂，发酵糖产酸变黄，产碱变红；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。
 |  |
| 小肠结肠炎耶尔森菌在改良克氏双糖琼脂上的特征 | 大肠埃希氏菌在改良克氏双糖琼脂上的特征 |
▶ 小肠结肠炎耶尔森菌在改良克氏双糖琼脂上的特征斜面底层变黄不产气。
▶ 注意事项：先在斜面划线，再与底层穿刺。由于培养36~48h后小肠结肠炎耶尔森菌会产碱，造成斜面变红，因此应注意培养时效，在培养24h时观察结果；
2、尿素酶实验
▶ 操作方法：用接种环挑取一满环可疑培养物，接种到尿素培养基，接种量要足够大，26℃±1℃培养2h~4h，若阳性不明显，则继续培养到24h后再观察。
▶ 尿素酶试验原理：具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养呈碱性，酚红指示剂在pH6.8时呈黄色，pH8.1呈粉红色。
▶ 结果判读：阳性为玫红色； 阴性为淡橙红色-淡黄色。
▶ 注意事项：接种量足够大。
3、动力实验
▶ 操作方法：将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中，于26℃±1℃和36℃±1℃培养24h。
▶ 动力观察原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、矿物质；氯化钠维持均衡的渗透压；较少量的琼脂作为培养基的凝固剂。
▶ 结果判读：测试菌有动力的话，就会沿穿刺线扩散生长，无动力就不会扩散生长。
▶ 小肠结肠炎耶尔森氏菌26℃±1℃温度下有动力，扩散生长； 36℃±1℃温度下没动力，不扩散沿穿刺线生长；
4、革兰氏染色镜检
▶ 操作方法：将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行纯化培养，用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。
▶ 小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8μm~3.0μm)×0.8μm
小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化鉴别表
其他相似菌生化鉴定
1、糖（醇）发酵试验
▶ 绝大多数细菌都能利用糖（醇）类作为碳源和能源，但是它们在分解糖（醇）的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖（醇）并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。
▶ （指示剂为溴甲酚紫）结果判读：阳性为变黄色；阴性为紫色。
2、葡萄糖磷酸盐胨水（VP试验）
▶ 某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸脱羧成为乙酰甲基甲醇，后面在碱性环境下被空气中的氧氧化成为二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色的化合物，即VP试验阳性。
▶ 小肠结肠炎耶尔森氏菌VP阳性。
3、鸟氨酸脱羧酶试验培养基
▶ 具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（鸟氨酸→腐胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显示出来。
▶ 结果判读：阳性为试验管为绿色-蓝绿色，对照管变黄色； 阴性为试验管和对照管均变黄色，或均不变色。
小肠结肠炎耶尔森氏菌生化鉴定盒（GB 4789.8-2016）
▶ 生化反应管：半固体琼脂、尿素（冻干）、葡萄糖磷酸盐胨水、鸟氨酸脱羧酶、氨基酸脱羧酶对照、蔗糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖。
▶ 配套试剂：无菌液体石蜡，VP试剂（甲液：6% α-萘酚乙液：40%氢氧化钾溶液），无菌水、生理盐水，麦氏比浊管。
小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型鉴定（选做项目）
1、检查培养物有无自凝性
▶ 使用接种在1.2%~1.5%固体琼脂平板上的新鲜培养物。在洁净玻片上滴加一滴生理盐水，将待测试培养物混合于生理盐水滴内，使之成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动30~60s，黑色背景下观察反应，若出现可见菌体凝集，即可认为有自凝性，反之无自凝性。无自凝性的参照下面方法继续鉴定。
2、血清型（O）鉴定
使用接种在1.2%~1.5%固体琼脂平板上的新鲜培养物，在玻片上划出2个约1cm×2cm 的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴O因子血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜轻轻摇动混合30~60s，并对着黑色背景进行观察，如O因子血清在2min内出现比较明显的小颗粒凝集者，且生理盐水区无凝集现象，即为阳性反应，反之为阴性反应。
小肠结肠炎耶尔森氏菌恒温荧光核酸快速检测法
全程最快仅需10h即可出检测结果；最低检测限为10-20CFU！！
质量控制及疑难解析
质量控制
1、实验室过程中，每批预增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
2、定期使用小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204或相应定量活菌参考品，在P2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，污染剂量应控制在10-100CFU/25g，并进行记录，验证实验至少每2个月进行1次。
3、每2个月将所使用的培养基和生化试剂用小肠结肠炎耶尔森氏菌的标准菌株或阴性菌株（如大肠杆菌ATCC25922）进行验证，并进行记录。
疑难解析
问：在前增菌或选择性增菌结束后，肉汤未见微生物生长，是否可以终止实验？
答：不可以，因为肉汤可见的细菌浓度为107CFU/ml，在此浓度一下，肉眼不能发现微生物生长，但实际溶液中有微生物生长。
问：为什么除乳制品外，其他食品前处理都要进行碱处理?
答：小肠结肠炎耶尔森氏菌相对耐碱，碱处理降低杂菌干扰，提出检出率；牛奶加减会使蛋白质变性成团，增加检出难度，故不需碱处理。
问：为什么使用VITEK 2 Compact 全自动微生物生化鉴定系统不能准确鉴定出小肠结肠炎耶尔森氏菌?
答：可以鉴定到属，不能鉴定到种，还需结合其他生化进一步鉴定到种。
所需培养基试剂
