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乳与乳制品中需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定
发布时间：2023-07-21 浏览次数：6531 分享：
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需氧芽孢总数测定1
嗜热需氧芽孢总数测定2
农业标准NY/T1331-2007标准中的定义：
需氧芽孢总数 total aerobic bacterial spores 指在有氧条件下，经80℃加热处理10min，能存活并且于36℃下培养48h在MPC琼脂平板上形成可计数的菌落总数。
嗜热需氧芽孢 thermophilic aerobic bacterial spores 指在有氧条件下，经100℃加热处理30min，能存活并且于55℃下培养48h在DTA平板上形成可计数菌落的微生物。
芽孢菌污染是现代乳制品生产加工过程中的污染之一。
原料乳、消毒奶、炼乳、奶粉中，均不同程度的耐热需氧和厌氧芽孢杆菌污染，如果这些耐热菌在奶制品中达到一定浓度，必然引起奶制品变质，它们会导致乳与乳制品品质下降、风味改变、保质期缩短及加工过程异常等，甚至危害人体健康。
01 污染源 ：① 乳的良好营养适宜微生物生长。据报道，芽孢杆菌属在原料乳中污染最严重。芽孢是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体。② 农场中的饲料、±壤和粪便等易受芽孢菌污染，牛舍周围也广泛存在芽孢菌，这些菌易污染奶牛乳头表面，使原料乳污染芽孢菌。
02 影响 ：这些耐热菌在奶制品中达到一定浓度，必然引起奶制品变质，它们会导致乳与乳制品品质下降、风味改变、保质期缩短及加工过程异常等，甚至危害人体健康。
03 检测原理：将样品加热处理以除去非芽孢菌，然后向样液中加入能为芽孢菌提供丰富营养的乳平板计数琼脂培养基，放入合适环境下培养，最后计数。
一、标准依据：农业标准NY/T1331-2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中第二部分：需氧芽孢总数测定。
二、原理：取一定量的液体检样或检样的初级稀释液，将其在80℃下加热10min，在MPC琼脂培养基内，于36℃条件下培养48 h，菌落计数，算出每毫升(克)检样中的需氧芽孢总数。
三、检测程序
四、接种及培养
1 检样处理
1.1 以无菌操作打开待检样品包装容器，液体样品应避免形成泡沫。
1.2 以无菌操作称取固体或半固体检样10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)预热至45℃的灭菌稀释液(蛋白胨-盐溶液或磷酸盐缓冲液)的三角烧瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇(必要时用均质器均质或无菌乳钵研磨)制成10-1初级稀释液。
2 加热处理
2.1 用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL~10mL于无菌试管中，注意不应使样液接触到超出水面和位于水面下2cm以内的试管内壁。
2.2 立即将上述试管放人80℃±1℃的水浴中，使试管内液面至少低于水面4cm。
2.3 加热处理10min±1min。在对照管中放一支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5min。
2.4 将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。
3 进一步稀释液的制备
用一支1mL无菌吸管，吸取1mL经加热处理的样液，于含有9mL无菌稀释液的试管中，振摇试管，混合均匀,，获得其10倍稀释液(液体检样10-1稀释液或固体检样10-2稀释液)。按上述操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管。
4 接种和培养
4.1 根据对样品中芽孢含量的估计，选择适宜的稀释度，即通过正确地选择，使得在培养结束后至少有一个培养皿里长出10个~150个菌落。分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL该稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度接种两个培养皿。
4.2 立即倾注12mL~15mL已融化并冷却至45℃±1℃的MPC琼脂培养基到每个培养皿中。
4.3 小心地转动培养皿使接种样液和培养基混合均匀，水平放置使混合物凝固。从热处理结束到接种样液和培养基混合所用的时间不得超过15min。
4.4 接种样液的同时，用1mL稀释液，作空白试验。
4.5 待琼脂凝固后，堆叠培养皿，倒置在培养箱中，于36℃±1℃培养48h±2h。
注：为了避免菌落蔓延使得无法计数，可采取以下措施：
① 待培养皿里的混合物凝固后，于其上再铺一层(约5mL)还保持液体状态的该培养基；
② 待培养皿里的混合物凝固后，翻转培养皿，于培养皿的盖子里放一片滤纸并在滤纸上漓几滴甘油。
五、菌落计数
1 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，需要时用放大镜检查。
2 蔓延的菌落被认为是单一菌落。如果被蔓延菌落所覆盖的部分不到平板面积的1/4，计数未受影响的平板部分的菌落并计算出整个平板的相对量。如果被蔓延菌落所覆盖的部分超过了平板面积的1/4，不应计数。
六、结果计算
1 保留含有10个~150个菌落的培养皿。
用公式(2)计算每毫升或每克样品中需氧芽孢总数：
2 如果所有稀释度培养皿中菌落数均少于10个，结果报告为“样品中需氧芽孢总数小于10×1/d CFU/mL(g)”，式中d为最低稀释液的稀释度。
3 如果所有稀释度培养皿中的菌落数均多于150个，结果报告为“样品中需氧芽孢总数大于150×1/d CFU/mL(g)" ，式中d为最高稀释液的稀释度。
一、标准依据：农业标准NY/T1331-2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中第三部分：嗜热需氧芽孢总数测定。
二、原理：取一定量的液体检样或检样的初级稀释液,，将其在100℃下加热30min，在DTA培养基内，于55℃条件下培养48h，菌落计数，算出每毫升(克)检样中的嗜热需氧芽孢数。
三、检测程序
四、接种及培养
1 检样处理
1.1 以无菌操作打开待检样品包装容器，液体样品应避免形成泡沫。
1.2 以无菌操作称取固体或半固体检样10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)预热至45℃的灭菌稀释液(蛋白胨-盐溶液或磷酸盐缓冲液)的三角烧瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠) ，经充分振摇(必要时用均质器均质或无菌乳钵研磨)制成10-1初级稀释液。
2 加热处理
2.1 用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL~ 10mL于无菌试管中，注意不应使样液接触到超出水面和位于水面下2cm以内的试管内壁。
2.2 立即将上述试管放入100℃的水浴中，使试管内液面至少低于水面4 cm。
2.3 加热处理30min±1min，从试管放人100℃水浴中开始计时。
2.4 将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。
3 进一步稀释液的制备
如果有必要，取一支1mL无菌吸管，吸取1mL经加热处理的样液于含有9mL无菌稀释液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得其10倍稀释液(液体检样10-1稀释液或固体检样10-2稀释液)。
4 接种和培养
4.1 根据对样品中嗜热需氧芽孢含量的估计，选择适宜的稀释度，即通过正确地选择，使得在培养结束后至少有一个培养皿里长出10个~150个菌落。分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL该稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度接种两个培养皿。
注：在每毫升(克)乳或乳制品中，常常只有少量的嗜热需氧芽孢。如果想测出它们的数量，可以采取以下措施：
① 在多个培养皿里接种足够量的经加热处理的液体样品或经加热处理的初级稀释液；
② 使用更大的培养皿，以能够在其中接种多于1mL经加热处理的液体样品或经加热处理的初级稀释液。
在报告结果时，必须要注明对检测方法进行的调整。
4.2 立即倾注12mL~15mL已融化并冷却至45℃±1℃的DTA培养基到每个培养皿中。
4.3 小心地转动培养皿使接种样液和培养基混合均匀，水平放置使混合物凝固。从热处理结束到接种样液和培养基混合所用的时间不得超过15min。
4.4 接种样液的同时，用1mL稀释液作空白试验。
4.5 待琼脂凝固后，堆叠培养皿，把其倒置在塑料袋里，然后将其放人培养箱中，于55℃±1℃培养48h±2h。
注：为了避免菌落蔓延使得无法计数，可采取以下措施：
① 待培养皿里的混合物凝固后，于其上再铺一层(约5mL)还保持液体状态的该培养基；
② 待培养皿里的混合物凝固后，翻转培养皿，于培养皿的盖子里放一片滤纸并在滤纸上滴几滴甘油。
五、菌落计数
1 做平板菌落计数时，可用肉眼观察,需要时用放大镜检查。
2 蔓延的菌落被认为是单一菌落。如果被蔓延菌落所覆盖的部分不到平板面积的1/4，计数未受影响的平板部分的菌落并计算出整个平板的相对量。如果被蔓延菌落所覆盖的部分超过了平板面积的1/4，不应计数。
六、结果计算
1 保留含有10个~150个菌落的培养皿。
用公式(3)计算每毫升或每克样品中嗜热需氧芽孢总数：
2 如果所有稀释度培养皿中菌落数均少于10个，结果报告为“样品中嗜热需氧芽孢总数小于10×1/d CFU/mL(g)”，式中d为最低稀释液的稀释度。
3 如果所有稀释度培养皿中的菌落数均多于150个，结果报告为“样品中嗜热需氧芽孢总数大于150×1/d CFU/mL(g)" ，式中d为最高稀释液的稀释度。
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