SN/T 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌检测  操作步骤

第一法   蜡样芽胞杆菌平板计数法

1 蜡样芽胞杆菌检测

1.1 样品的稀释

1.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液或0.85 %生理盐水的无菌均质杯中，以8000 r/min~10000 r/min的转速匀质1 min~2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用排击式均质器拍打1 min~2 min，制成1:10样品匀液。

1.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置于盛有225 mL磷酸缓冲液或0.85%生理盐水的无菌稀释瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中充分混匀，制成1:10样品匀液。

1.1.3 用1 mL的无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，加到盛有9 mL磷酸缓冲液或0.85 %生理盐水的试管中，充分混匀，制成1:100的样品匀液。

1.1.4 按1.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，直至适宜稀释倍数。

1.2 样品的接种

根据对样品污染状况的估计，选择2~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取0.1mL样品匀液加入MYP平板琼脂平板，然后用无菌L棒均匀涂布于整个平板，注意不要触及平板边缘，每个稀释度接种两个MYP琼脂平板。

1.3 培养

1.3.1 在通常情况下，涂布之后将平皿静置10 min~30 min，待样品匀液吸收后翻转平板，30℃±1℃培养24 h。如果培养物的菌落特征不显著，则继续培养至48 h。

1.3.2  蜡样芽胞杆菌在MYP琼脂平板上生长的典型菌落为直径2 mm~5 mm，菌落表面粗糙，在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色，环绕产生5 mm宽的卵磷脂酶沉淀环。没有根状生长的特性（蕈状芽孢杆菌形成根状生长的特征）。

1.4 菌落计数

选取菌落数在15 CFU~150 CFU的典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板，进行计数。

注：如果有很多发酵甘露醇的细菌，会影响到典型菌落，使之减少或消失。少量的蜡样芽胞杆菌无卵磷脂酶沉淀环，这些菌同样需要证实实验。

1.5 营养琼脂斜面或平板培养基

从每个平板上挑取5个典型菌落，如无典型菌落，则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，分别接种于营养琼脂斜面或平板，30℃±1 ℃培养24 h，取培养物进行革兰氏染色和证实实验。

1.6 证实实验

1.6.1 葡萄糖发酵实验：将培养物接种到酚红葡萄糖肉汤中，置于厌氧培养箱中36 ℃±1 ℃培养24 h，振摇后肉汤由红变黄，表明在厌氧条件下蜡样芽胞杆菌分解葡萄糖产酸。

1.6.2 硝酸盐还原实验：将培养物接种到硝酸盐肉汤中，36 ℃±1 ℃培养24 h，加0.25 mL亚硝酸盐试剂A和0.25 mL亚硝酸盐试剂B，在10 min内变为红色为阳性反应。

1.6.3 改良V-P实验：将培养物接种到改良V-P培养基中，36 ℃±1 ℃培养24 h，取1 mL培养物置于灭菌空管中加入0,2 mL40 %KOH溶液和0.6 mL5%α-萘酚乙醇溶液和少量结晶肌酸。静置1 h出现伊红粉红色为阳性。

1.6.4 L-酪氨酸分解实验：将培养物接种到L-酪氨酸琼脂培养基上，36 ℃±1 ℃培养48 h在靠近菌落生长的地方培养基为透明的，则表明酪氨酸被分解，阴性则继续培养至72 h，结果仍为阴性的弃去。

1.6.5 溶菌酶试验：将培养物接种到0.001%溶菌酶营养肉汤中，另取培养物接种到普通营养肉汤中作为对照，36 ℃±1 ℃培养24 h，蜡样芽胞杆菌在本培养基中能生长，为阳性反应。如出现阴性反应继续培养 24 h，结果仍为阴性弃去。

1.6.6 符合MYP琼脂上的典型菌落形态，镜检为革兰氏染色阳性大杆菌，呈链状，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，并且在厌氧条件下发酵葡萄糖产酸，还原硝酸盐为亚硝酸盐，改良V-P试验阳性，分解L-酪氨酸，能在0.001%溶菌酶中生长的进行如下实验：

1.6.7 蜡样芽胞杆菌与类似菌的鉴别试验：

动力实验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30 ℃±1 ℃培养24 h。有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生产，而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。

溶血试验：将疑似菌点种在绵羊血琼脂表面，30 ℃±1 ℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌会观察到强烈的β-溶血反应。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

蛋白毒素结晶试验：取经30 ℃±1 ℃培养24 h并于室温放置2 d~3 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，用灭菌蒸馏水做显微涂片。待干燥后将涂片慢慢通过火焰，短暂加热固定。待冷却后，用甲醇盖满涂片，30 s后弃去甲醇，通过火焰使其充分干燥，再将涂片盖满0.5 %碱性复红水溶液或石碳酸复红ZN染色液。用微火轻轻从底部加热玻片至产生蒸汽为止。过1 min~2 min，再重复这个步骤。静置30 s，弃去染液。用蒸馏水充分冲洗玻片，待其自然干燥。在显微镜油镜下观察是否有游离的芽孢和毒素晶体。如果未见游离芽孢，可将培养物在室温下多放置几天后进行试验。苏云金芽胞杆菌产生四角晶形（菱形）的暗色蛋白毒素晶体，蜡样芽胞杆菌不产生毒素晶体。

1.6.8 符合蜡样芽胞菌群特征的，呈强烈溶血，有活泼的动力，不产生蛋白毒素结晶的培养物，可确定为蜡样芽胞杆菌。

1.7 可替代的生化实验

如选择API 50 CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统，可按照1.5从营养琼脂斜面或平板上挑取培养物，用生理盐水制备成浊度适当（根据仪器要求）的菌悬液，使用API 50 CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

2 结果计算

2.1 平板上的有效菌落数的计算见式（1）

a=b/A*C················（1）

式中：

a——平板上的有效菌落数；

b——根据证实实验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数；

A——进行证实实验的菌落数；

C——平板上的菌落数。

同一稀释度有效菌落数的平均值计算公式见（2）

···············（2）

式中:

——同一稀释度有效菌落数的平均值；

——同一稀释度有效菌落数的和。

若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按（3）计算：

················（3）

N——样品中蜡样芽胞杆菌数；

——连续两个稀释度的有效菌落数的平均数之和；

V——加样量（0.1 mL或1 mL）;

d——连续两个稀释度中较低的稀释度。

例：将检样1^0-5、10^-6连续两个梯度稀释液0.1 mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的疑似蜡样芽胞杆菌菌落数分别为137、148和21、17个，各取5个进行鉴定，证实为蜡样芽胞杆菌的分别为3、4和4、4个，则每一稀释度的有效菌落数的平均数分别为100、15 CFU。则1 g样品中蜡样芽胞杆菌数为：

(100+15)/(0.1*11*10^-3)=115/(1.1*10^-6)) =1.0×10⁸ CFU/g

2.2 若同一稀释度屁股办上只有一个平板菌落在适宜范围之内，则计算此平板的有效菌落数，然后与其相邻稀释度的有效菌落数的平均值求和，再通过式（3）计算求值，即为每克（或毫升）中蜡样芽胞杆菌。

2.3 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜范围内，计算此稀释度的有效菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量，即为每克（或毫升）中蜡样芽胞杆菌数。

2.4 若所有稀释度的平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，计算此稀释度有效菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量，即为每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌数。

2.5 若所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU，则对稀释度最低的平板进行计数，计算此稀释度有效菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量，即为每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌数。

2.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU~150 CFU之间，其中一部分小于15 CFU而另一部分大于150 CFU时，则最接近15 CFU或150 CFU的平板进行计数，计算此稀释度有效菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量，即为每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌数。

3 蜡样芽胞杆菌平板计数的报告

根据MYP琼脂平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按2中公式计算，报告每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌数，以CFU/g（或CFU/mL）表示；如果最低稀释倍数的两个培养皿均没有菌生长则结果可表述为每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌数小于1乘以最低稀释倍数（如果是液态样品的原液，则结果可以表述为每毫升样品中蜡样芽胞杆菌数小于1）。

第二法   蜡样芽胞杆菌MPN计数

3检验程序

3.1 蜡样芽胞杆菌MPN计数法检验程序见图2

3.2 MPN计数法试用于蜡样芽胞杆菌数≤10³/g的情况

4 操作步骤

4.1样品的稀释

样品的稀释按1.1进行.

4.2样品的接种和培养

每个样品选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可选择原液），每个稀释度接种3管已酪胨大豆多粘菌素肉汤（TSPB），每管接种1 Ml.（如果接种量超过1 mL，则用双料 TSPB，每管接种10 mL），30 ℃培养48 h。

4.3 分离

从出现浑浊的试管取培养物划线接种到MYP琼脂上，30 ℃±1 ℃培养24 h。如果培养物特征不显著，可延长培养24 h。蜡样芽胞杆菌在MYP 琼脂平板上典型的菌落为表面粗糙，在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色，环绕产生5 mm宽的卵磷脂酶沉淀环，没有根状生长的特性。

4.4 营养琼脂斜面或平板培养

从每个MYP琼脂平板上挑取5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触 菌落中心部位，分别接种于营养琼脂斜面或平板，30 ℃±1 ℃培养24 h，取培养物进行革兰氏染色和证实实验。

4.5证实实验

证实实验按1.6、1.7进行。

5 蜡样芽胞杆菌MPN计数结果报告

根据证实实验确定为蜡样芽胞杆菌的管数，只要有1个菌落鉴定为蜡样芽胞杆菌，其所代表的TSPB管即为蜡样芽胞杆菌阳性。依据TSPB阳性管数查MPN表（见行标附录B），报告每克（或毫升）样品中蜡样芽胞杆菌MPN值。

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