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GB4789.7-2013 副溶血性弧菌检测及其注意事项
发布时间：2020-12-15 浏览次数：1137 分享：
副溶血性弧菌的生物学特性
生物学特性：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）属于弧菌科弧菌属，革兰氏阴性，无芽孢，呈弧状、杆状、卵圆状等多种形态，单端鞭毛；兼性厌氧菌，嗜盐、对葡萄糖、甘露醇、麦芽糖等发酵产酸。
流行学特征：主要存在于温带地区海水、海水沉积物和鱼虾、贝类等海产品中，是沿海国家及地区食品中毒的主要致病菌，主要污染水产制品或交叉污染肉制品等其他食品，人食用这些生、半生或交叉污染的海产品，可能导致急性肠胃炎、反应性关节炎等，有时甚至引起原发性败血症。
副溶血性弧菌的检验
操作注意事项
1：样本在收集后应该立即被冷却（7~10 ℃ ），然后尽快检验；
2：带贝壳类或甲壳类样品前处理时，应先在符合生活饮用水卫生标准的流水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳后取样；
3：注意分离时所选增菌液的部位，副溶血性弧菌在3%氯化钠碱性蛋白胨水中增菌后呈均匀混浊生长，培养基表面容易形成菌膜，分离时，要求“液面以下1cm内”，在这个范围内，应该目标菌最多、没有干扰的区域；
4：一般样品中含有多种弧菌比较常见，分离时一定要在平板上多级稀释划线，不要一条线划线到底，培养出来发现没有分开。
培养基原理解析
3%氯化钠碱性蛋白胨水：
▶蛋白胨提供碳源、氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠和高pH值可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长。
硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：
▶配方中多价蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；胆酸钠、牛胆汁粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚蓝和麝香草酚蓝是pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。
▶副溶血性弧菌不发酵蔗糖，不会使培养基pH降低，因而在该培养基上为绿色菌落，创伤和拟态弧菌都不发酵蔗糖，需进一步确证鉴定，霍乱弧菌发酵蔗糖为黄色。
副溶血性弧菌为绿色菌落
弧菌显色培养基：
▶配方中蛋白胨和酵母膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；蔗糖为可发酵的糖类；抑菌剂抑制大部分非弧菌细菌，氯化钠可维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；混合色素与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上产生品红色菌落(副溶血性弧菌)和绿-蓝绿色的菌落(霍乱弧菌和创伤弧菌) 。
副溶血性弧菌为品（紫）红色菌落
3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：
▶胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长；琼脂为凝固剂。
氧化酶试验：
▶原理：氧化酶使细胞色素C氧化，氧化型细胞色素C再氧化对苯二胺试剂形成紫色复合物，产生颜色反应 。
▶操作：滴加1滴氧化酶试剂到一小块洁净滤纸上，用玻棒或接种环（铂或塑料）挑取适量新鲜菌苔涂在试剂润湿的纸片上；30秒内出现蓝紫色为阳性，延迟反应或无颜色变化为阴性。
3％氯化钠三糖铁琼脂：
▶蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、维生素、矿物质；乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁；较高含量的氯化钠维持弧菌均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。
副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁琼脂上的特征
嗜盐性试验：
▶挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
赖氨酸脱羧酶试验培养基：
▶具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显示出来。
▶结果判读：阳性为试验管为绿色-蓝绿色，对照管变黄色； 阴性为试验管和对照管均变黄色，或均不变色。
赖氨酸脱羧酶试验阳性
3%氯化钠甘露醇发酵试验
▶绝大多数细菌利用糖（醇）类作为碳源和能源，代谢产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等），使酸碱指示剂变色来断定。
▶（指示剂为溴甲酚紫）结果判读：阳性为变黄色； 阴性为紫色。
3%氯化钠甘露醇发酵试验
3%氯化钠葡萄糖磷酸盐胨水（VP试验）
▶某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸脱羧成为乙酰甲基甲醇，后面在碱性环境下被空气中的氧氧化成为二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色的化合物，即VP试验阳性。
我妻氏血琼脂（神奈川试验）
▶酵母膏粉、蛋白胨提供氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠可以抑制非弧菌的细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长；磷酸氢二钾为pH缓冲剂；甘露醇为可发酵的醇；结晶紫抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；兔血红细胞用于检测副溶血性弧菌是否具有特定溶血素；琼脂为凝固剂。
▶阳性结果为菌落周围呈半透明环的β溶血。
副溶血性弧菌神奈川试验阳性
ONPG试验
▶β-半乳糖苷酶试验是以有些细菌可产生β半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻硝基酚。
ONPG试验
副溶血性弧菌的生化特性
副溶血性弧菌恒温荧光核酸快速检测法
质量控制及疑难解析
质量控制
1： 实验室过程中，每批预增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
2： 定期使用副溶血性弧菌ATCC17802或相应定量活菌参考品，在P2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，污染剂量应控制在10-100CFU/25g，并进行记录，验证实验至少每2个月进行1次。
疑难解析
Q1： 在TCBS上生长为绿色的菌落可确定是副溶血性弧菌吗？
因为不发酵蔗糖能在TCBS上生长的细菌，在TCBS上都是绿色菌落，因此需做确证试验。
Q2：使用VITEK2GN卡做副溶血性弧菌鉴定结果不稳定怎么办？
建议增加3%氯化钠三糖铁琼脂和嗜盐性试验确证，最好使用手工生化确证。
Q2：如何保存副溶血性弧菌？
由于副溶血性弧菌在4 ℃以下不稳定，14~49天进入活的非培养状态，建议短期室温保存用工作菌株。
所需培养基试
