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肠道集聚性大肠埃希氏菌EAEC核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
编号：FZ018BF2
规格：48测试/盒
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编号：022179
规格：100g/瓶
产品名称：肠道集聚性大肠埃希氏菌 EAEC 核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
英文名称：Multiplex PCR Detection Kit for Enteroaggregative E. coli (Fluorescent Probe Assays)
产品编号与包装规格：
| 编号 | 规格 |
| FZ018BF2 | 48 测试/盒 |
产品简介：本试剂盒仅适用于食品样本中肠道集聚性大肠埃希氏菌 EAEC 的定性检测。
检测原理：基于 Real Time PCR 技术，利用针对肠杆菌科的 16S rRNA 基因和 EAEC 的毒力基因astA、aggR、pic 设计的引物、荧光探针以及其他反应优化配置所需试剂，加入待检样品的核酸即可进行扩增反应。在发生扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被 Taq 酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量 PCR 仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定肠道集聚性大肠埃希氏菌 EAEC 的类型。
astA、aggR、pic、16S rRNA 基因分别对应荧光报告基团 FAM、VIC、Cy5、ROX。
肠道集聚性大肠埃希氏菌 EAEC 核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)产品组分：
储存条件与保质期：-20℃避光储存，有效期为 12 个月，避免反复冻融。
灵敏度：单通道最低检验限达到 100 CFU/Test
所需其他材料和适用仪器：单荧光定量 PCR 仪（具有能够检测 FAM、VIC、Cy5、ROX 标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。
肠道集聚性大肠埃希氏菌 EAEC 核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)使用指南：
1，样品前处理
1) 参照 GB 《4789.6−2016》，使用 1μL 接种环刮取新鲜培养的待鉴定的可疑菌落到含 30 μL 裂解液的无菌离心管中，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热 10 min；
2) 12000 r/min 离心 15 min，上清即为粗提的 DNA，可转移至 0.2 mL 无菌离心管中，在-20℃下可长期保存。也可以选择商业化的细菌基因组提取试剂盒进行提取。
2, 加样、反应
1) 按照需求取 n 个 PCR 反应管（n=1 管阴性对照+待检测样品数+1 管阳性对照），从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，以上每管加入 20 μL 预混液，待用。
2) 向上述 n 个反应管中分别加入阴性对照、待测样品 DNA、阳性对照各 5 μL，总反应体积为 25 μL。盖紧管盖，短暂离心，立即进行 PCR 扩增反应。
3) PCR 反应体系为 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 检测通道，在反应阶段 2 中60 ℃时收集荧光信号，具体程序如下：
| 反应阶段 | 温度 | 时间 | 信号收集 | 循环数 |
| 1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
| 2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
| 60°C | 40 sec | ✔ |
3, 结果：一般情况下，可通过软件自动设定的基线、阈值等直接读取检测结果。如需调整，可根据所使用仪器的自身情况（如噪声等）以及选取的不同荧光通道进行调整。
1) 质量控制：阴性对照未出现明显的 S 型扩增曲线或 Ct 值＞37，阳性对照出现 S 型扩增曲线且其 Ct 值＜30。若阴阳性对照不同时满足上述条件，则本次检测结果无效，应重新检测或与产品技术支持联系。
2) 结果判读：（根据反应所得 Ct 值判读，具体见下表：）
| Ct值 | 每个基因判读结果 |
| ≤35 | 对应的基因阳性。 |
| 35~37 | 建议重新检测，若复测结果Ct≥37，则对应的基因阴性，反之为阳性。 |
| ≥37 | 对应的基因阴性。 |
❖ astA 和 pic 基因可在细菌间转移，当与其他 DEC 毒力基因检测结果同时阳性时，则 astA 和 pic 基因不作为型别判定依据。
❖ 阴性对照反应 16S rRNA 基因可能会有弱阳性现象，不作为阳性结果判定依据。
❖ 多重 qPCR 检测可能出现不同荧光通道之间竞争抑制的问题，单基因分析时适当调整阈值线。
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