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HKV104-01A pAvi-C Expression Kit
编号：HKV104-01A
规格：1μg/20次
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氯化钠蛋白胨缓冲液(pH7.0,无菌)瓶装颗粒 250g/瓶
编号：022116P1
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编号：HKE005-02A
规格：1ml×5
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全自动菌落计数器 SmartCounter-4K/C(带电脑)
编号：18043927PC
规格：SmartCounter-4K/C（带电脑）
产品名称：pAvi-C Expression Kit
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 | 产品介绍 | 价格 |
| HKV104-01A | pAvi-C Expression Kit | 1μg/20次 | 表达载体 | 750 |
产品描述：
pAvi-C 专为目标蛋白 C 端融合 Avi Tag 设计，是预先用 Nde I 线 性 化 的 载 体 ， 可 配 合 Plus PCR 一 步 定 向 克 隆 试 剂 盒 （Cat.No：HKNR005）使用，用于在大肠杆菌中快速高效表达和 蛋白质 Biotin 标记。为保证标记效率，请选择高表达 Biotin 化酶的 宿主菌 Biotin Competent Cell（Cat.No：HKV207）。
目的基因扩增按常规方法设计引物后，在 5´端引物前添加以 下序列：GAA GGA GAT ATA CAT；3´端引物前添加：GAT GTC GTT CAG GCC 。
注意：5´端引物从第一个氨基酸开始（ATG），3´端引物不要 包含终止密码子。
产品特点：
pAvi-C 用于在大肠杆菌中快速高效表达和蛋白质 Biotin 标记。
PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,完成质粒构建。
保存温度：-20℃
pGST-TEV Expression Kit 产品包装（A包装）：
| 产品组成 | 体积 |
| pAvi-C（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
质量保证：pAvi-C 线性化载体经过严格的自连测试 以 及连接效率测试，满足下游实验需求。
注意事项：
1）目的片段的 PCR 产物建议纯化，避免引物 二聚体等杂质影响连接反应。
2）目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
3）引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端一致。
使用方法：
A 目的片段的获得
目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两 端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR 扩增 的保真度，请尽可能选用高保真酶，推荐使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp，包括 5'端 与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表达载体克隆构建，引物设计完成后，请注意 检 查读码框是否正确。）
B 目的片段与载体的重组
C 转化（我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下：）
1，冰上融化一支感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬 起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中，用移 液 枪吹打混合，冰上放置 30 分钟。
2，将离心管置于 42℃水浴中，热击 60-90 秒，迅 速将离心管置于冰上，放置 2-3 分钟。
3，向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培养基中，37℃摇床，150rpm 振荡培 养 45 分钟，使质粒上氨苄抗性基因表达，菌体复 苏。
4，吸取 200μl 已转化的感受态细胞，加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上，用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开，将平板置于 37℃培养箱里直至液体完 全吸收，倒置培养 12-16 小时。
D 阳性克隆鉴定
PCR 检测，利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接进行菌落 PCR 鉴定。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们 建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目 的 片段特异性引物。
PAvi-C 结构图：
| T7 promoter | 27-43 |
| lac O | 46-70 |
| Avi Tag | 118-162 |
| T7 Terminator | 257-303 |
| F1 origin | 340-795 |
| Kan resistance | 891-1703 |
| pBR322 ori | 1799-2472 |
| lacI CDS | 3846-492 |
