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产品名称：pGST-TEV Expression Kit
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 | 产品介绍 | 价格 |
| HKV103-01A | pGST-TEV Expression Kit | 1μg/20次 | 表达载体 | 960 |
产品描述：
本质粒以 Nde I 线性化方式提供，请配合 Plus PCR 产 物一步无缝克隆试剂盒使用（Cat.No. HKNR005）。GST 是实验室中最常用的融合标签之一，能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。Thormbin 作为常用的切除 GST 标签的蛋白酶，常常出现在目标蛋白中，从而限制了其应用。pGST-TEV 质粒在 Thormbin 位点后引入了TEV 蛋白酶切点，极大的增加了标签切除的特异性。
目的基因扩增按常规方法设计引物后，在上游引物 5´端引物前添加以下序列：CTC TAC TTC CAA GGT；下游引物 5´端引物前添加：GAG TCG GAC GAA TTC。
产品特点：
GST 融合标签能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。
TEV Protease 切点的引入便于酶切结果的判断和目标蛋白质的分离。
Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,完成质粒构建。
应用实例：
保存温度：-20℃
pGST-TEV Expression Kit 产品包装（A包装）：
| 产品组成 | 体积 |
| pGST-TEV（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| TEV Protease（10U/μl） | 10μl |
质量保证：pGST-TEV 线性化载体经过严格的自连 测试以及连接效率测试。
注意事项：
1）目的片段的 PCR 产物建议纯化，避免引物二聚体等杂质影响连接反应。
2）目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
3）引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp序列与线性化载体的两端一致。
使用方法：
A 目的片段的获得
目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR 扩 增的保真度，请尽可能选用高保真酶，推荐使用 Fast Pfu DNA聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每条引物长度至少在 35-40bp，包括 5'端与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表达载体克隆构建，引物设计完成后，请注意检 查读码框是否正确。）
B 目的片段与载体的重组
C 转化（我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下：）
1，冰上融化一支感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中，用移液 枪吹打混合，冰上放置 30 分钟。
2，将离心管置于 42℃水浴中，热击 60-90 秒，迅速将离心管置于冰上，放置 2-3 分钟。
3，向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的LB 或 SOC 培养基中，37℃摇床，150rpm 振荡培养 45 分钟，使质粒上氨苄抗性基因表达，菌体复苏。
4，吸取 200μl 已转化的感受态细胞，加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上，用无菌涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全吸收，倒置培养 12-16 小时。
D 阳性克隆鉴定
PCR 检测，利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接进行菌落 PCR 鉴定。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议 一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
pGST 结构图：
| Tac promoter | 184 -212 |
| GSTTag | 258 -932 |
| TEVsite | 933 -956 |
| Amp resistance | 1380-2240 |
| pBR322 Ori | 2395-3014 |
| lacI CDS | 3444-4403 |
| lacZ alpha | 4526-4969 |
