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产品名称：pTrx-TEV Expression Kit
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 | 产品介绍 | 价格 |
| HKV102-01A | pTrx-TEV Expression Kit | 1μg/20次 | 表达载体 | 960 |
产品描述：
本质粒以 Nco I 线性化方式提供，请配合 Plus PCR 一步定向 克隆试剂盒（Cat. No：HKNR005）使用。Trx 是实验室中 最常 用的融合标签之一，能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折 叠。在需要用 TEV 蛋白酶（Cat. No: HKPE004）切割的时候， 经常会产生非特异性切割，产生两个标签带。pTrx 通过删除部 分氨基酸序列，在保留原有 Trx 融合蛋白质优势的同时，避免了 非特异性酶切，使酶切结果的判断和目标蛋白质的分离变的更加 方便。
目的基因扩增按常规方法设计引物后，在上游引物 5´端引 物前添加以下序列：CTC TAC TTC CAA GGT；下游引物 5´端引 物前添加：TTC GGA TCC GAT ATC。不希望目标蛋白C 端保留 His Tag 时，3´端引物需要加入终止密码子。
产品特点：
改造后的 Trx 融合标签能够促进目标蛋白质的溶解性和正确 折叠。
特异性切割，便于酶切结果的判断和目标蛋白质的分离。
Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便, 一步完 成质粒构 建。
保存温度：-20℃
pTrx-TEV Expression Kit 产品包装（A包装）：
| 产品组成 | 体积 |
| pTrx-TEV（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| TEV Protease（10U/μl） | 10μl |
质量保证：pTrx-TEV 线性化载体经过严格的自连测 试 以及连接效率测试，满足下游实验需求。
注意事项：
1）目的片段的 PCR 产物建议纯化，避免引物 二聚体等杂质影响连接反应。
2）目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
3）引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端一致。
使用方法：
A 目的片段的获得
目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两 端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR 扩增 的保真度，请尽可能选用高保真酶，推荐使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp，包括 5'端 与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表达载体克隆构建，引物设计完成后，请注意 检 查读码框是否正确。）
B 目的片段与载体的重组
C 转化（我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下：）
1，冰上融化一支感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬 起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中，用移液 枪吹打混合，冰上放置 30 分钟。
2，将离心管置于 42℃水浴中，热击 60-90 秒，迅速 将离心管置于冰上，放置 2-3 分钟。
3，向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培养基中，37℃摇床，150rpm 振荡培养 45 分钟，使质粒上氨苄抗性基因表达，菌体复苏。
4，吸取 200μl 已转化的感受态细胞，加到含氨苄青 霉素的 LB 或 SOC 固体平板上，用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开，将平板置于 37℃培养箱里直至液体完 全吸收，倒置培养 12-16 小时。
D 阳性克隆鉴定
PCR 检测，利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接进行菌落 PCR 鉴 定。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议 一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的 片段 特异性引物。
pNovoTrx-TEV 结构图：
| T7 promoter | 686 -702 |
| lac O | 659-683 |
| Trx Tag | 123 -614 |
| Enterokinase site | 219-233 |
| T7 Terminator | 26 -72 |
| F1 origin | 5356- 5811 |
| Amp resistance | 4367- 5224 |
| ColE1 Ori | 3546 -4219 |
| lac I CDS | 1093 - 2172 |
