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产品名称：sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit
中文名称：sgRNA体外一步转录试剂盒
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 | 产品介绍 | 价格 |
| HKE369 | sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit | 10次 | crispr基因编辑（一步法sgRNA 体外转录试剂盒） | 1275 |
产品描述：
CRISPR/Cas9 是 一 种 来 源 于 细 菌 获 得 性 免 疫 的 由 RNA 指 导 Cas9 蛋 白 对 靶 向 基 因 进 行 编 辑 的 技 术 。 CRISPR/Cas9 的切割是通过向导 RNA(gRNA)与打靶基因组位置之间约 20bp 碱基的配对，且打靶序列的 3′端需要有 PAM 结构(NGG)，再引导 Cas9 作用实现的。CRISPR/Cas9 与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM 处 10~12 bp碱基的配对，而其余远离PAM 处8~10 bp 碱基的错配对靶位点的识别影响不明显，这导致了CRISPR/Cas9 存在一定的脱靶性，可能发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性以及 研究工作量的大量增加。澳门·威斯尼斯网站CRISPR/Cas9 基因编辑系统能有效解决这一问题。
sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit（一步法sgRNA 体外转录试剂盒）能够一步法体外高效转录不同的 sgRNA 片段，进一步通过 sgRNA 体外筛选及基因型鉴定试剂盒（Cat.No:HKE370）筛选出脱靶率低的 sgRNA，用 于后续科研实验。
产品特点：
一步法高效转录不同的 sgRNA 片段，操作简单快捷；
sgRNA 产量可达 10-30μg。
保存条件：-20℃保存，或-80℃长期保存。
sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit 产品组成：
| 产品组成 | 体积 |
| 2×sgRNA Reaction Buffer | 150 μL |
| Enzyme Mix | 20 μL |
| DNase I(2U/μL) | 10 μL |
| RNase Free Water | 1 mL |
流程模式：
操作步骤：
I，sgRNA 模板扩增
扩增引物设计（选取Target DNA序列PAM（NGG）的5'端20 bp 进行正向（F）引物设计，引物结构包含T7 promoter（20 bp）、Target DNA 片 段（20 bp）和实际与反向引物结合的片段（21 bp）。引物设计如下：）
II，sgRNA 体外转录体系
依次加入以下反应组分配制转录体系：
| 2×sgRNA Reaction Buffer | 10 μL |
| 正向引物(10 μM) | 2 μL |
| Enzyme Mix | 2 μL |
| RNase Free Water | To 20 μl |
37 ℃保温 1 h、70℃保温 10 min
注： 转录时间0.5-2 h 即可，如需得到更多 sgRNA，可适当延长至 3 h。
III，sgRNA 纯化
模板 DNA 的去除：向转录产物中加 1μL DNase Ⅰ，37°C 反应10 min，以去除 DNA 模板，将反应产物放入 75℃反应 10 min， 得到 的 sgRNA 置于-20℃保存。sgRNA 可直接用于切割，如需纯化，可选择以下 sgRNA 纯化步骤，但 sgRNA 会有所 损失。
sgRNA 纯化(可选)：
1. 转录体系 20 μL 用 RNase Free Water补至 300 μL，加入等体积酚•氯仿•异戊醇（25:24:1），充分混合后， 12000 rpm，4°C 离心 15 min。
2. 取上清，加入 300μ L 氯仿，充分混匀后，12000r pm，4℃离心 5 min。
3. 取上清约 200 μL，为提高回收量，下层可再加入 100 μL RNase Free Water，充分混合后，4℃离心 5 min， 取上清。
4. 将两次取的上清合并，总体积约 300~350 μL，加入 2 倍体积的异丙醇和 1/10 体积的用 RNase Free Water 配置的 3M NaAc，-80°C 沉淀过夜。
5. 离心取沉淀，加入 1 mL RNase Free Water配制的 75%乙醇，洗涤两次。
6. 用 20 μL RNase Free Water溶解 RNA，电泳检测质量并进行浓度测定。
应用实例：
图例一：使用一步法sgRNA 体外转录 试剂盒转录sgRNA，大小为97 nt。
泳道1：DL2000；
泳道 2、3、4：sgRNA
图例二：将转录出的sgRNA 做体外 切割检测。
泳道 1：DL2000；
泳道 2 、3 ： sgRNA 切割后条带 1500bp、1000bp、500bp
