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产品名称：质粒DNA小量纯化试剂盒（硅胶膜柱法）
英文名称：Plasmid DNA purification kit（Silica membrane）
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|
| TQ005D1 | 质粒DNA小量纯化试剂盒（硅胶膜柱法） | 100次/盒 |
产品简介：本产品采用硅胶膜柱法，适合于从1~5 mL 新鲜细菌培养液中提取质粒DNA。纯化的质粒可直接用于自动测序、酶切、PCR 和标记等。30分钟可以完成数个样品的抽提工作，整个过程不会接触酚氯仿等有机物抽提，也不需醇类沉淀。
储存条件及有效期：Buffer P1和RNA酶2~8℃保存，其他可室温保存，有效期1年（储存过程中若溶液产生沉淀，使用前将其在室温放置一段时间或37℃条件下温育，待充分溶解后摇匀即可使用）。
样本类型：新鲜菌体培养液。
质粒DNA小量纯化试剂盒（硅胶膜柱法）试剂盒组成：
| 序号 | 产品组成 | 规格 |
|---|---|---|
| 1 | Buffer P1 | 26 mL |
| 2 | RNA酶 | 10 mg |
| 3 | Buffer P2 | 26 mL |
| 4 | Buffer NP3 | 36 mL |
| 5 | Washing Buffer | 27 mL（使用前加108 mL无水乙醇） |
| 6 | Elution Buffer | 10 mL |
| 7 | DNA硅胶膜吸附柱 | 100套 |
| 8 | 使用说明书 | 1份 |
质粒DNA小量纯化试剂盒（硅胶膜柱法）试剂盒 使用方法：
● 初次使用前加入0.2~0.5 mL Buffer P1 至RNase A 干粉中，吸打5~10次让RNase A 充分溶解，然后把 RNase A溶解液全部转移至 Buffer P1瓶中，于2-8℃保存；
● 初次使用前请在Washing Buffer中加入108 mL无水乙醇，参见瓶身标签或使用说明书。
1、将含质粒的菌种接种于含合适抗生素的1~5mL LB肉汤培养基中，37℃摇床培养12~16 小时；
2、吸取1~5mL菌体，12,000×g 离心2分钟;
3、倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打吸尽残液。加入 250 μL Buffer P1（已加入RNase A），高速涡旋重悬细菌。
注意：使用前确保 RNase A 已加到 Buffer P1 中。彻底重悬细菌很关键，重悬后应看不到细菌团块;
4、往重悬液中加入 250 μL Buffer P2，颠倒混匀 8~10 次。注意：需轻轻颠倒混匀，溶液变得粘稠且透亮表明细菌已充分裂解。如有必要，室温放置2~3分钟，其间颠倒混匀几次。处理多个样品时，这一步操作时间不要超过4分钟;
5、加入350 μL Buffer NP3，立即颠倒8~10次让溶液彻底中和。加入Buffer NP3 后应立即颠倒混匀，以防止沉淀团聚而影响中和效果，静置2 分钟;
6、14,000×g 离心5分钟;
7、将 DNA硅胶膜吸附柱装在收集管中。小心转移离心得到的上清液至柱子中。12,000×g离心60秒;
8、弃滤液，把柱子套回收集管中。加入 650 μL Washing Buffer (已加入无水乙醇)至柱子中静置30 秒。12,000×g 离心 60 秒;
9、弃滤液，把柱子套回收集管中。12,000×g 离心3分钟清除残余滤液；
● 将柱子套在灭菌的1.5 mL 离心管中可开盖静置5 分钟让残留的乙醇尽可能挥发干净，乙醇残留会降低OD260/OD230的比值。
10、把硅胶膜吸附柱套在灭菌的1.5mL 离心管中。根据需求加入30-100μL预热至65℃的 Elution Buffer 或灭菌水至柱子的膜中央。静置 3 分钟，12,000 ×g离心1分钟洗脱DNA。柱子最低的洗脱体积为30 μL。低于30μL会导致洗脱效率下降。若需要获得最高产量，可用洗脱液重复该步骤进行第二次洗脱；
● Elution Buffer可用无菌去离子水替代，但pH值应在8.0~8.5。
● 将Elution Buffer预热到65℃使用，可提高质粒DNA得率。
● 为提高质粒DNA提取得率，可将洗脱得到的溶液再次吸出滴加到吸附柱中央，静置几分钟后再次离心收集。
11、弃硅胶膜吸附柱，把抽提得到的质粒保存于-20℃。
纯度及浓度检测分析：
1、提取得到的质粒DNA可用紫外分光光度计测量浓度与纯度。
2、DNA在OD 260处有明显的吸收峰，在此条件下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50 μg/mL；单链DNA或RNA为40 μg/mL；寡核苷酸为20 μg/mL。
3、OD260/280=1.7~1.9，如果A260/280≤1.7或比值过低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质污染，需要纯化样品。若DNA样品中A260/280>2.0表明样品有RNA或DNA降解。
4、Elution Buffer使用去离子水时候，OD260/280会偏低，但不表示纯度低。
质粒DNA小量纯化试剂盒（硅胶膜柱法）试剂盒 使用注意事项：
1、可先将菌种划线至合适的含抗生素的平板上，待长出单菌落后，挑取长势较好的单菌落接种至含抗生素的LB肉汤中培养12~16 h，这样有利于提高质粒得率。
2、本试剂盒提取使用的器皿、移液器等均应为专用，离心管、枪头等一次性耗材需进行高压灭菌。操作人员应穿戴洁净工作服、口罩、帽子、使用一次性无粉手套。
3、尽量使用新鲜菌液提取，可以降低质粒DNA丢失的风险。
4、Buffer P2使用后需尽快盖上瓶盖，减少与空气中的CO2接触，尽量避免影响提取效果。
5、Washing Buffer使用后盖紧盖子，以免乙醇挥发影响提取效果。
6、如果质粒DNA需长期保存，建议使用Elution Buffer洗脱，分装保存于-20℃或-80℃。
7、请严格按照本说明书操作步骤进行，不同批号的试剂若无特殊说明，请勿混合使用，并保证在有效期内使用该试剂盒，因操作不当导致的质粒DNA提取效果不佳，本公司概不负责。
8、妥善处理所有样本和试剂材料，彻底清洁和消毒操作台面。
